OECD发布多项认可的替代试验方法，严重眼损伤和刺激的规定性方法组合(BCOP+)详解

2022年6月30日，OECD测试指南通过了10项实验方法（表1）。其中体外方法共7项，涉及皮肤致敏、眼刺激、遗传毒性和内分泌干扰。体外科学31介绍了指南文件442E新增的附件4:基因组变应原快速测试法(GARD™skin)。本期介绍OECD新增指南文件TG 467: 严重眼损伤和刺激的规定性方法。

表1 2022年OECD更新认可的替代方法

方法	OECD指南编号	首次认可时 间
皮肤致敏AOP的蛋白结合关键事件化学试验法--附录3:动态DPRA法(kDPRA)	442C	2022.6.30
体外皮肤致敏的ARE-Nrf2 荧光素酶试验方法	442D	2018.6.27
体外皮肤致敏的树突细胞关键事件，附录4:基因组变应原快速测试法(GARD™skin)	442E	2022.6.30
严重眼损伤和刺激的规定性方法	467	2022.6.30
哺乳动物红细胞 Pig-a基因突变分析	470	2022.6.30
眼危害识别的重建人角膜样上皮(RHCE) 试验方法	492B	2022.6.30
急性经口毒性的上下程序法	425	2008.10.16
H295R类固醇生成试验	456	2022.6.30
转基因啮齿动物体细胞和生殖细胞基因突变分析	488	2022.6.30

一、规定性体外方法的组合

目前OECD已发布了7个眼严重损伤和刺激性的替代方法，包括437、438、460、491、492、494和TG496。这些方法是标准化的、预测模型确定的和可以作出判定的，被称为规定性方法。鉴于单一方法的局限性和范围，这些体外方法产生的数据应当组合使用，并与物理化学性质，计算毒理学和化学类似物的交叉参照等判断性方法一起作为证据进行WOE预测。在整合测试和评估方法(IATA)制订的原则下，如何进行方法的组合是实践中需要解决的问题。

规定性方法（define approaches, DA）：由一组固定来源的数据和信息 (指数据的类型)加上一个解释数据的算法(指数据的解释过程)组成，通常作为毒性预测的一种方式。规定性方法是可以被准确验证和标准化的。

判断性方法（judgement-based approaches, JBA）：指需要依靠专家判断得到安全性结论的方法，方法中的元素只能做到部分协调一致，例如，交叉参照方法。

二、OECD 467要点

OECD467包含了两种基于规定性方法的用于非表面活性剂液体眼刺激性测试的组合，测试结果可用于法规监管目的，即用于危害识别中区分GHS的三个类别：第1类(Cat.1)严重眼损伤，第2类(Cat.2)眼睛刺激和无分类（No Cat.）。这两种方法都以BCOP为核心方法，分别组合了体外重建人类角膜样上皮试验和短期暴露试验。

规定性方法1(DAL-1)，基于物理化学性质和体外数据，用于眼睛危险识别，用于纯非表面活性剂液体。组合方法为牛角膜浑浊和渗透性试验（BCOP,TG437)和重建人类角膜样上皮试验(RhCE，TG492），以及测试化学物质的物理化学性质。

规定性方法2(DAL-2)，基于体外数据，用于非表面活性剂的纯液体、液体和固体。组合方法为BCOP和体外短时间暴露试验(STE,TG491)。

三、规定性方法组合1（DAL-1）

DAL-1有2个组合方案，取决于选择角膜上皮的类型。

DAL-1方案1（理化+RhCE+BCOP）；第一步先根据物理化学排除（WS：mg/mL水溶性；或LogP：辛醇-水分配系数；VP：mmHg；蒸汽压力；ST:纯液体的表面张力），第二步RhCE测试方法用于识别无分类，第三步BCOP LLBO，用于识别分类1。

DAL-1组合方案2（RhCE+理化+BCOP）；第一步用于确定无分类的RhCE测试，第二步：物理化学排除（WS：mg/mL水溶性；或LogP：辛醇-水分配系数；VP：蒸汽压力mmHg；ST：纯液体的表面张力）以确定无分类，第三步BCOP LLBO用于识别分类1.

四、规定性方法组合2（DAL-2）

组合方法2采用了BCOP+STE两个方法的组合。测试顺序可以选择自上而下法或自下而上法，既可从STE测试方法开始，然后进行BCOP LLBO测试方法；也可以先从BCOP开始，再进行STE测试。

五、适用范围

组合方法适用的液体化合物涵盖了广泛的用途和化学品类别，包括各种有机官能团(79个不同的)，参考了根据OECD QSAR工具箱分析(3.2版）。这些化学物质包括小分子和大分子，以及疏水物质和亲水物质。其适用性如下：

1、两个组合的目的不是为了区分2A类和2B类。

2、两个组合均不适用于固体（即不能用移液枪吸取的物质）和某些表面活性剂。

3、DAL-1不适用于表面活性剂和固体物质。DAL-1适用于纯液体，不包括混合物、UVCBs和多成分物质。对于浓度为>为5%和<为20%的杂质，还需要确定杂质的理化性质，只有当所有成分符合排除标准时，预测液体为无分类。在所有其他情况下，进行RhCE测试方法。

4、DAL-2不适用于分散在水中的表面活性剂和固体物质。DAL-2适用于非表面活性剂的液体、液体和固体。

六、预测能力

DAL-1和DAL-2用于眼危害识别的预测能力：

规定性 方法	DAL-1与组合方法1(N=94)	DAL-1组合方法2 (N=86)	DAL-2 (N=164)
信息来源	理化特性，EpiOcular™ EIT (TG 492), BCOP LLBO (TG 437)	SkinEthic™ HCE EIT (TG 492), BCOPLLB O (TG 437)	STE (TG491), BCOP LLBO(TG 437)
与动物实验的一致性	70.5% 无分类(N=55) 59.1% 分类2(N=22) 76.5% 分类1(N=17)	79.7% 无分类(N=46) 68.7% 分类2 (N=23) 76.5% 分类1 (N=17)	85.3% 无分类(N=123) 56.3% 分类2(N=24) 81.2% 分类1(N=17)

举例介绍—BCOP

01 方法概述

牛角膜混浊和通透性(Bovine Corneal Opacity and permeability assay ，BCOP)试验于2009年被采纳为经济合作与发展组织（Organisation for Economic Cooperation and Development,OECD)测试指南437，并于2013年进行了更新，修订了预测模型，确定了其在鉴别严重刺激性和腐蚀性，以及无刺激性中的作用（OECD，2013年）；2020年重新修订版本改进了浊度仪，提高了测试结果的稳定性，简称BCOPLLBO法（OECD2020）。BCOP可作为家兔体内眼刺激试验的替代方法，有效地规避了传统 Draize 兔眼试验存在的评分主观性、重复性差、耗时、方法残忍等不足，具有相对准确的量化指标，可以满足产品精确定量评价的要求。

02 合规性

牛角膜的BCOP检测是一种有效可行的测试，能够识别全球化学统一分类和标签系统(GHS)分类的非刺激物和严重刺激物，满足进出口化学品/化妆品原料的需求。

03 适用性

选用天然3D角膜，要满足各种剂型、颜色和溶解性的样品的测试需求。可以单独或组合使用，全面评估产品的安全性。

04 科学性

鉴于上皮刺激（包括角膜、口腔粘膜、皮肤、气道等）的共性，除了可用于化妆品和眼科用药物的测试之外，BCOP及改良方法还可用于口腔护理、鼻腔接触、家居护理产品的测试。

05 IATA性

BCOP评估了角膜损伤，但低估了受试物对虹膜和角膜的刺激作用，可以选择整合测试策略(IATA)，BCOP作为鲁棒性极佳的方法，可满足不同组合的需求。如雅诗兰黛等企业常用的BCOP-CAMVA组合方法，日本企业常用的BCOP-STE组合方法，温和产品常用的 类角膜上皮+BCOP，BCOP-NRR组合、BCOP-人体斑贴组合方法，以及打通眼刺+皮刺的BCOP-Episkin组合方案等。不管通过自下而上（Bottom-up）程序，或者是自上而下程序（Top-down），BCOP方法都是核心的成员。

06 功效性

天然角膜是具有屏障结构、基质结构和内皮结构的完整体系，还有感觉神经末梢和上皮干细胞分布。可用于与屏障损伤及修复、基质老化及退化、内皮应激及扩张、光敏/畏光/抗蓝光、再生重建、角膜药物吸收、上皮促渗等功效宣称的研究和测试。

参考文献

[1]OECD (2020), OECD Guidelines for the Testing of Chemicals No. 437: Bovine Corneal Opacity and Permeability Test Method for Identifying i) Chemicals Inducing Serious Eye Damage and ii) Chemicals Not Requiring Classification for Eye Irritation or Serious Eye Damage, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4.

[2] OECD (2020), OECD Guidelines for the Testing of Chemicals No. 491: Short Time Exposure In Vitro Test Method for Identifying i) Chemicals Inducing Serious Eye Damage and ii) Chemicals Not Requiring Classification for Eye Irritation or Serious Eye Damage, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4.

[3] OECD (2019), OECD Guidelines for the Testing of Chemicals No. 492: Reconstructed human Cornea-like Epithelium (RhCE) test method for identifying chemicals not requiring classification and labelling for eye irritation or serious eye damage, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4

[4]OECD (2019). Series on Testing & Assessment No. 263: Guidance Document On Integrated Approaches to testing and assessment (IATA) for serious eye damage and eye irritation.

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